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摘 要：白藜芦醇是葡萄和葡萄酒中的一种重要功能性化合物,其含量多少不仅极大影响着果实和葡萄酒的品质,而且和植株本身在生长发育阶段适应性强弱有着密切相关性.本文对葡萄中白藜芦醇的研究进行文献综述,包括白藜芦醇的结构与分布特征、白藜芦醇在人体内和葡萄体内的活性与功能研究、提取与检测方法、葡萄中白藜芦醇的含量及其遗传规律、葡萄白藜芦醇的诱导表达调控等方面,并进一步对未来如何高效选育高白藜芦醇含量葡萄品种及结合生物技术手段就其工业化改良提了一点建议.
关键词：葡萄；白藜芦醇；生物合成；转录调控；紫外线
中图分类号：G252.8 文献标志码：A
DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2018.04.026
我国葡萄生产区域极广,除广东、海南和台湾省外,其他各省、市、自治区均有经济产量的报告,产量居前5位的分别为新疆、河北、陕西、山东、云南,占全国总产量的50％以上[1].目前种植的葡萄多数是欧亚种品种（V. vinifera ）,仅有少数是由美洲葡萄（V. labrusca ）,河岸葡萄（V. riparia ）,圆叶葡萄（V. rotundifolia ）和山葡萄（V. amurensis ）等种类选育或是与欧亚种杂交而来的品种.
葡萄栽培品种众多,但大多数品质优良的葡萄酿酒及栽培品种对多种病原微生物包括真菌、细菌与病毒等病原菌的抗性很差.其中,真菌病害如病、霜霉病、白腐病和黑痘病是危害葡萄生产的主要病害,它们不仅会引起的产量下降,并且严重降低葡萄酒的品质.目前,对这些病害的应对措施依赖于化学防治[2],然而,化学防治在增加农业生产成本的同时,会加剧生态环境的污染,甚至还对人类健康产生极大负面影响.为了从长远和根本上解决葡萄抗病性差的问题,需要选育抗病品种进行推广栽培,这是葡萄生产和育种上的重要课题.因此,葡萄的品质和抗性机理需要被不断挖掘和应用,白藜芦醇（Resveratrol）是其中的一个作用因素,本文试就葡萄中白藜芦醇的功能与生物合成调控的研究进展作一综述.
1 白藜芦醇的结构与分布特点
1.1 白藜芦醇理化性质
白藜芦醇又称芪三酚,化学名称为3,4´,5-三羟基二苯乙烯,是天然芪类化合物的代表,分子式为C14H12O3,相对分子量为228.25 kD,是无色针状晶体,难溶于水,易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等极性溶剂.芪类化合物是具有二苯乙烯母核的一类化合物的总称,羟基为主要取代基,取代位置主要在3、4´、5位.1940年日本人Tokaoka首次从毛叶黎芦（Veratrm grandiflorum ）根部分离得到白藜芦醇[3],1974年在葡萄属植物中叶找到了白藜芦醇,并首次定性为一种葡萄属植物对真菌侵染、伤害、紫外线照射后的反应产物——植物抗毒素（phytoalexin）,并将其命名为viniferins（即葡萄素）[4].在自然界中,白藜芦醇多以单体或其糖苷（piceid, 3,5,4´-三羟基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷）形式存在,最常见的有4种形式：顺、反式-白藜芦醇（cis/trans-resveratrol）和顺、反式-白藜芦醇苷（cis/transpiceid）.白藜芦醇羟基也可以被、甲氧基或糖苷取代,形成一系列衍生物.天然芪类化合物可以以单体的形式存在,也可以形成低聚体.白藜芦醇多存在于植物的木质部,目前已经在二十余科的植物中发现,包括豆科、桑科、蓼科、松科、桃金娘科、山毛榉科、葡萄科等[5].白藜芦醇的顺式异构体光敏性强、极不稳定[6],其反式异构体的生物活性强于顺式异构体[7],在紫外光照射下反式-白藜芦醇能够转化为顺式-白藜芦醇.白藜芦醇在光下极不稳定,反式-白藜芦醇在完全避光时,可在乙醇中稳定存在数月,但反式-白藜芦醇在高pH（≥10）下稳定性较差；而顺式-白藜芦醇在避光条件下只有在中性pH下较稳定.自然界中常以反式-白藜芦醇、顺式-白藜芦醇苷及反式-白藜芦醇苷存在于植物中.
1.2 白藜芦醇在葡萄中的分布与含量
近年来,关于白藜芦醇在葡萄中的分布已有了大量的研究,但在葡萄的不同组织器官及不同的品种中,白藜芦醇的含量不同,且差异很大.Pool等[8]发现木质部中含量较低,成熟叶片中含量较幼叶高.果皮、果穗梗中含有较多的反式-白藜芦醇,而葡萄芽和花中白藜芦醇含量较低[9],其他研究者也认为,葡萄果实中白藜芦醇主要存在于果皮和种子中,果肉中很少或没有[10].陈雷和韩雅珊[11]发现,葡萄品种间各组织白藜芦醇含量的差异较大,总体而言,反式-白藜芦醇含量从高到低的顺序是：果穗轴、果皮、叶片、种子、叶柄.Li等[12]连续两年研究发现除少数品种含量较高外,大部分品种的果皮和种子中白藜芦醇含量小于2 μg/g FW,而在果肉中基本没有检测到反式-白藜芦醇.李婷等[13]测定14个品种葡萄不同器官组织的反式-白藜芦醇含量,其含量由高到低的顺序为果梗、叶片、果皮、种子、叶柄.研究表明,葡萄中的各个器官都含有白藜芦醇,‘赤霞珠’的各个部位都有反式-白藜芦醇,但是含量不同,高低顺序依次为：茎段韧皮部、腋芽、根、茎段木质部、茎尖、叶柄、叶片,但是在芪合酶（STS）mRNA的转录和蛋白质翻译在叶片中最高,对白藜芦醇合成的关键酶STS进行免疫组织化学分析表明：STS mRNA在不同的器官中具有组织特异性,与蛋白质的含量分布是一致的[14].
白藜芦醇的含量在不同品种异很大,Li等首次从种质资源水平上评价葡萄白藜芦醇含量,发现种间杂交的砧木品种果皮和种子含有比其它栽培品种高得多的白藜芦醇[12].种质资源中白藜芦醇含量的调查研究表明,在大多数研究的葡萄种质中,高抗性的砧木品种如‘贝达’等含有365.98 μg/g的白藜芦醇,而在酿酒和鲜食葡萄果皮中白藜芦醇含量较低,以及美洲葡萄与欧亚种之间的种间含量较亲本更低.此外,它们的总分布在很大程度上偏向于低含量,其含量远远低于平均水平.然而,在栽培品种中也存在一些特例,例如‘维纳斯无核’（Venus）（154.77 μg/g FW）,‘皇后无核’（Queenors Seedless）（102.19 μg/g FW）等品种仍具有相对较高的白藜芦醇含量[15].
2 白藜芦醇的功能及其体内外活性
2.1 白藜芦醇与葡萄抗病性的关系
白藜芦醇是在植物受到病原性进攻和环境恶化时产生的植物抗毒素,它的含量与植物抗菌能力呈正相关.有人认为,白藜芦醇抗葡萄灰霉的活性与其电子特性、分子体积及亲脂性大小有关,它可破坏细胞膜并干扰电子传递系统的蛋白质[16].白藜芦醇可以抑制植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发.例如,Alonso-Villerde等[17]的研究证明,葡萄植株一旦被病原菌感染,就会在感染部位迅速产生高浓度强毒性的δ-葡萄素（δ-viniferin）和紫檀芪（pterostilbene）,并发现葡萄体内的芪类化合物能有效地防御3种主要真菌病原菌：灰霉菌（Botrytis cinerea ）、霜霉菌（Plamopara viticola ）和菌（Erysiphe necator ）.目前,白藜芦醇对真菌的毒性机理尚未得到揭示,但通过表达STS 基因获得抗病植物的策略已被大量成功地用于了植物的遗传转化.在应用STS 基因进行遗传转化的研究中,多数植物过量表达STS 基因后对特定真菌病害的抗性增强.例如,Hain等[18]将从葡萄中分离出的两个芪合酶基因Vst 1和Vst 2转入烟草,使得烟草植株对灰霉菌具有了更高抗性,这也成为外源植保素基因在植物中表达提高其抗病性的首次报道.此研究发现,STS 转基因植物对稻瘟菌、病菌、早疫病菌的抗性均有一定程度的增强,但同一种植物转基因植株间的抗病能力存在一定的差异.其它外源转化葡萄STS 基因并取得成功的例子还包括：转STS 基因的小麦提高了对灰霉病、柄锈菌与壳针孢的抗性[19],转化大麦提高了对灰霉病的抗性[20],转化欧亚种葡萄提高了对灰霉病的抗性[21],转化番木瓜提高对棕榈疫霉菌的抗性[22].Duan等[23]证实,不同葡萄品种对霜霉病的易感性高低与白藜芦醇在植株中的诱导合成能力呈显著负相关,进一步说明葡萄白藜芦醇能直接提高植株的抗病性.
2.2 白藜芦醇在健康领域的应用
1997年,Jang等研究发现,白藜芦醇在癌变的三个主要阶段（始发、促癌和演进）中均表现出化学防癌活性[5].在小鼠乳腺培养细胞的癌变模型中,他们证实白藜芦醇能抑制肿瘤的形成.这篇文献的发表使白藜芦醇的抗肿瘤活性成为研究的热点,同时也使更多的研究者开始关注白藜芦醇,也因此被誉为继紫杉醇后又一新的绿色抗癌药物[24].
随后,在动物实验中,白藜芦醇的各类功效被不断证实.2000年前后的一系列研究表明,高剂量的白藜芦醇在体内具有抗炎、清除自由基、抑菌和防癌的作用.在我国,早已使用含白藜芦醇的中药材虎杖已用于治疗和预防高血脂、动脉硬化.同时,白藜芦醇可以从多个方面对心血管发挥保护作用[25].此外,《自然》上的一项研究表明,即使采用比以往的一些著名研究中低1000倍剂量的白藜芦醇,都可以显著地激活抗衰老的信号通路,从而导致肿瘤抑制基因p53 和长寿基因FOXO3A 与SIRT6的活化,这说明日常生活中从食物中获得的白藜芦醇是足够产生功效的[26].
3 白藜芦醇的体内合成途径
包括白藜芦醇在内的芪类化合物,在植物体内是通过苯丙氨酸代谢途径合成的.合成过程受到多种酶的调控,依次为苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（H）、香豆酰-CoA连接酶（4CL）、芪合酶（STS）.其中芪合酶是芪类化合物合成的关键酶,它可以催化丙二酰-CoA和香豆酰-CoA合成白藜芦醇,或催化丙二酰-CoA和肉桂酰-CoA生成赤松素.白藜芦醇可以继续经羟基化、糖基化等修饰,或通过聚合生成多种芪类物质.
目前对葡萄中芪类化合物开展的研究比较多.对已报道的葡萄科植物中的芪类化合物进行统计,发现共从葡萄科植物分离得到54种芪类化合物,其中来源于葡萄的有13种,约占总数的24%[27].由于STS在芪类化合物生物合成途径中起着重要的调节作用,被发现是芪合物合成的限速酶,因此近年来芪合酶基因的研究得到了人们的广泛关注,并取得了一系列进展.
STS 基因多以基因家族的形式存在,即它们是由同一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因.对从松树、葡萄、虎杖等植物中分离出来的STS 基因的研究结果显示,对于相同植物STS 基因家族的不同成员,它们的氨基酸序列具有非常高的相似性.王西平等[28]利用RTPCR从中国野毛葡萄克隆了2个cDNA全长均为1179 bp的芪合成酶基因VqSTS 1和VqSTS 2,它们编码的392个氨基酸中仅有12个氨基酸不同,氨基酸序列中247～257位点的“IPNS/FAGAIAGN”是芪合成酶家族固有的氨基酸保守结构域.通过查找葡萄全基因组,发现在欧洲葡萄‘黑比诺’中,共有48条STS 基因,其中至少32条基因是具有功能的[29].
4 白藜芦醇合成的表达调控
白藜芦醇是葡萄中一种重要的植保素,一方面被认为参与了植物体内的非生物与生物胁迫的适应性,另一方面具有很好的药理学活性,被证实在人体内有很好的防突变、抗癌与抗氧化的活性.由于STS 本底表达水平很低,只在受多种逆境诱导表达才会大量合成表达,因此,它的表达受到严格的转录调控.从分子水平上研究STS 的表达调控机制,是了解葡萄白藜芦醇积累规律的重要内容.多项研究表明,白藜芦醇在不同类型的葡萄种质中含量变异非常大,几乎从0到400 μg/gFW[12].而对这些白藜芦醇含量差异极其显著的种质中STS 基因表达量及功能进行分析后发现,白藜芦醇与STS 表达量高度正相关,且STS 是白藜芦醇合成的限速酶[30].此外,葡萄受到不同生物胁迫（如真菌感染）和非生物胁迫（UV-C、干旱、机械损伤）时,其合成的关键结构基因STS 被诱导表达,且表达量上升达30～40倍,白藜芦醇含量在叶片和果实中快速积累[31].上述系列研究表明,葡萄果实中白藜芦醇的含量差异极有可能是由转录调控途径上的差异造成的,然而,STS 基因具体受到哪些基因的表达调控,其上游的表达调控网络是如何构成的,是一个十分复杂但有吸引力的科学问题.
针对这一问题,科研人员进行了广泛而深入的探索.在用麦角甾醇诱导葡萄灰霉病抗性提高的过程中,Laquitaine等[32]发现了STS 与WRKY基因及LTP 基因协同表达,暗示WRKY基因可能作用于STS 基因的上游,从而直接或间接参与了STS 的表达调控.随后,Wu等[33]从抗病的华东葡萄及不抗病的两个欧亚种中分别克隆出了STS 基因的3条启动子,序列结构分析结果表明,STS 核心启动子区域存在可被WRKY转录因子结合的W-Box元件,其中,欧亚种中W-box数目较华东葡萄中多出1个.随后,H?ll等[34]通过葡萄愈伤组织过量表达及叶片的瞬时转化,首次报道了葡萄MYB14与MYB15转录因子参与了STS 的表达调控,但研究未能深入揭示它们转录激活STS 的机理.2015年,Fang等[35]研究发现,MYB14通过结合在STS 基因启动子的L5-BOX顺式作用元件上起到直接的转录激活作用,且在葡萄的32条有功能的STS 基因启动子区,29条含有该L5-BOX元件.与此同时,对于高白藜芦醇含量和低白藜芦醇含量的葡萄品种而言,它们分别对应着不同的STS 与MYB14的表达量,因此,STS 与MYB 14的表达量是决定葡萄白藜芦醇含量的直接因素.此外,大量基因芯片共表达分析的结果表明,有更多的基因协同参与了对STS 的表达调控.这一发现随后被Vannozzi等[36]的研究工作证实,他们发现WRKY基因家族的3个成员可以与MYB家族成员协同调控STS 基因的表达.除了已知的转录因子参与到STS 的表达调控,Jiao等[37]还发现VqMAPKKK38基因可以正向调控芪合成酶基因的表达而提高葡萄芪类物质的积累,同时钙离子信号和活性氧（ROS）信号位于VqMAPKKK38基因的上游,激活VqMAPKKK 38的表达,进而正调控葡萄芪合成酶基因的激活和芪类物质的积累.在转录因子的上游,钙信号系统被认为参与调控植物生长发育和病程相关基因的表达,其中,山葡萄中钙依赖型蛋白激酶VaCPK 20的过量表达使葡萄中VaSTS 7基因转录水平提高并且白藜芦醇的积累高出对照9～68倍[38].对葡萄愈伤组织进行转基因研究的结果表明,CPK 29对白藜芦醇的合成也有显著的促进作用,暗示此基因可能在转录因子的上游发挥调控作用[39].以欧亚种为试材的研究表明,MYB14启动子受flg22的诱导过程中也依赖于钙离子信号系统的激活[40].上述结果说明,STS 的表达调控网络上存在多个上游信号,影响了包括R2R3-MYB 及WRKY基因家族转录因子的表达,从而协同调控一系列STS 基因的表达,进而帮助植物适应多种逆境胁迫环境.
5 展望
尽管目前已在多种植物中发现了芪类化合物,但大部分植物中白藜芦醇含量较低,具有开发价值的植物并不多,而随着白藜芦醇的药理活性和保健功能不断发现,其在人类健康领域具有越来越好的应用开发前景,而葡萄因为其较高的含量与较好的安全性倍受关注.目前就白藜芦醇的提取而言,不同的组织可以选用不同的浸提剂,总的来说,乙酸乙酯或甲醇效果较好,且HPLC仍是最广泛与成熟的白藜芦醇定量检测的方法；然而,未来可能需要开发更加快捷的基于HPLC-MS等广泛靶向代谢组学的方法去对不同白藜芦醇的衍生物进行研究,一方面可以实现对多种次生代谢产物（如果实或葡萄酒中的类黄酮、有机酸、多酚类）的高通量检测与联合分析,另一方面新技术的应用可能会发现更多种类的白藜芦醇衍生物或聚合物.
尽管悬浮培养是白藜芦醇的工业化生产的一种选择,然而,选择何种葡萄品种及起始培养材料作为细胞供体能实现白藜芦醇的最大化生产,则需要探讨白藜芦醇生物合成表达调控的关键因子.利用已经发现的白藜芦醇生物合成调控基因,并以它们为靶点,运用遗传转化、CRISPR-Cas9介导的基因敲除等手段去精准调控关键结构基因的表达从而决定白藜芦醇的合成,可能是实现未来白藜芦醇产业化发展的一个重要方向.
近年来,尽管白藜芦醇生物合成的表达调控已经取得了一些突破性的进展,包括鉴定到了以MYB 14/MYB15为核心,与WRKY协同作用的多个正调控转录因子,然而,基因的转录调控涉及一套精细复杂的信号网络,目前的研究仅揭示了STS 启动子调控的一部分上游信号,远未能阐明葡萄白藜芦醇响应逆境胁迫表达与不同种质中差异积累的分子机制；同时,对植株的抗病性及高白藜芦醇含量葡萄育种而言,可能需要利用多样化的种质资源,尤其在含量极高的野生种质如冬葡萄（V.berlandieri ）与河岸葡萄（V. riparia ）或高抗病种质如华东葡萄(V. pseudoreticulata ）中,明确在其中白藜芦醇高效积累的规律,而后通过基因组学、转录组学、代谢组学等多学科交叉的手段进一步挖掘白藜芦醇生物合成表达调控的信号组分是非常有必要的,此项工作一方面可以进一步明晰葡萄对外界不利环境适应性进化产生差异的原因,另一方面有利于生产上实现少施农药并提高果实品质的葡萄健康生产.
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