高效液相色谱-串联质谱测定食品中西地那非等11种非法添加药物的方法改进与比较,本文是关于比较研究方面论文范文素材跟高效液相色谱相关在职毕业论文范文.
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摘 要：西地那非等均属于5磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂的处方药,于1998年经美国食品药品监督管理局批准,是治疗男子勃起功能障碍（ED）的有效药物,但长期或超剂量服用易对心血管系统、神经系统、消化系统等造成严重损伤.随着人们健康意识的增强,各种含有人参、枸杞、红枣、蛹虫等中药或动植物的保健酒越来越多,而不法商家为了谋取暴利,在保健酒中随意添加西地那非,给消费者的健康埋下极大隐患,也造成行业中乱象丛生.2015年7月31日,国家食品药品监管总局发布通告,近51家企业,在69种保健酒、配制酒中非法添加了西地那非等化学物.因此,我们有必要建立对于西地那非等非法添加药物的检测.
关键词：高效液相色谱-串联质谱；西地那非；非法添加；比较与改进对于PDE5及其衍生物的检测方法,国内基本采用的是高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）法,其仅通过保留时间和光谱图定性,会经常受杂峰干扰,出现假阳性的情况.而高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS）具有高灵敏度和高选择性,可成为非法添加化学成分定性确证的有效工具.目前,关于西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、那红地那非、伐地那非、伪伐地那非、他达那非、氨基他达那非、红地那非11种物质的方法检测尚未形成国家标准,现国内关于那非等非法添加物的检测还只局限于一种或几种.
本文通过高效液相色谱-串联质谱法测定11种非法添加药物残留量的定性、定量分析方法.通过对样品前处理、色谱柱、流动相等条件进行比较,采用乙腈水提取,HypersilGold-C18 分离柱（150mm×4.6mm,3μm）分离,乙腈和水（0.1%甲酸+5mM乙酸铵）为流动相,以电喷雾离子源正离子多反应监测（MRM）模式进行MS/MS检测.该方法11种混合药物在1.0ng/mL-40ng/mL浓度范围内线性良好,相关系数均达到0.999以上,添加3个水平的平均回收率为91.4%-118.9%,相对标准偏差(RSD,n等于6) 为2.5%-7.9%.并检测了配制酒、保健品、功能性饮料等50批次样品中的11种非法添加物,效果良好.
一、材料与方法
1.主要仪器与试剂.
1.1仪器.液相色谱-三重四级杆串联质谱仪：AB/SCIEX
QTRAP 4500,美国AB/SCIEX公司,配有电喷雾电离源（ESI）；振荡器：TTL-800型,北京同泰联科技发展有限公司；台式高速离心机：TG16-WS型,长沙市平凡仪器有限公司；漩涡混合仪：VORTEX型,美国Scientific Industries公司；超声波清洗器：BK-900C,济宁丰鑫超声设备有限公司；电子天平：BSA224s型,北京赛多利斯仪器系统有限公司.
1.2试剂.标准品西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西
地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、那红地那非、伐地那非、伪伐地那非、他达那非、氨基他达那非、红地那非,均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇：色谱纯,上海安谱有限公司；甲酸：AR,上海国药有限公司；试验用水为超纯水.
1.3试验材料.试验所用样品均采自湖南省食品质量监督
检验研究院日常抽检.
2.方法.
1.1不同样品前处理比较.方法A：准确称取2g试样
（精确至0.01g）于50mL容量瓶中,加入40mL乙腈,超声30min,冷却至室温,用乙腈定容至刻度,摇匀,上清液经微孔滤膜过滤,上机测定.方法B：准确称取样品2.0g（精确至0.01g）于50.0mL比色管中,用纯水溶解,涡旋混匀后超声30min,冷却至室温后定容至刻度,摇匀,上清液经微孔滤膜过滤,上机测定.方法C：准确称取样品2.0g（精确至0.01g）于50.0mL比色管中分别加入25.0mL20%、40%、60%、80%的乙腈水溶液,涡旋混匀后超声30min,冷却至室温后定容至刻度,供液相色谱-串联质谱仪测定.其提取试剂及浓度、稀释定容液的选择经试验优化得出.
1.2标准溶液的配制.混合标准储备液的配制：精确称取
西地那非等11种标准品10.0 mg,用乙腈定容至10.0 mL,得到混合标准储备液,浓度为1.0mg/mL,于-20℃冰箱保存.混合标准工作液的配制：准确移取一定量的混合标准储备液,用乙腈配制成100ng/mL的标准中间液,用20%的乙腈水溶液稀释,配制成一系列的混合标准工作液,其浓度梯度为： 0.00ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL.
1.3不同色谱条件比较.不同色谱柱选择比较：选择
Hypersil Gold-C18（150 mm×4.6mm,3μm）、BEH C18（100×2.1mm,1.7μm）及SB-C18（3.0 mm×50 mm,1.8μm）三种色谱柱进行比较.不同流动相条件比较：选择水相（含0.1%甲酸+5mM乙酸铵）和乙腈、水相（含0.1%甲酸）和乙腈、水相（含5mM乙酸铵）和乙腈三种不同流动相进行比较,通过优化得到最佳梯度洗脱程序,洗脱程序见表1.其他参考条件保持一致,柱温：35℃；流速：0.200 mL/min；进样量：5μL.
1.4质谱条件.离子源：电喷雾离子化源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：MRM多反应监测,雾化器压力：25Psi；辅助加热气：5L/min；干燥气温度：330℃；离子喷雾电压2500V；毛细管温度：350℃,另定性离子对、定量离子对、碎裂电压及碰撞能量等参数经试验优化得出.
二、结果与分析
1.质谱条件的优化.
根据11种目标化合物的化学结构及分子量,分别进行了质谱参数的优化,先通过全扫描方式找到母离子,MS2模式全扫描得到二级质谱扫描图,找到2-3个子离子,再逐个对子离子进行碎裂电压及碰撞电压的优化.定性离子对、定量离子对、碎裂电压及碰撞能量参数如表2.
2.不同样品前处理方法比较.
（1）三种方法的结果比较.分别用三种方法对西地那非阳性样品配制酒、伽玛片糖果、胶囊进行测定,其中方法C的提取液用80%的乙腈水溶液.结果如表3所示.由表可知,对于配制酒,三种方法的结果相差不大,而伽玛片糖果、胶囊（保健品）的结果有明显不同,这可能是因为产品基质不同,有部分物质不溶于水或不溶于乙腈,导致目标物无法与提取试剂接触,提取效率不高,故方法C最优.
（2）方法C提取溶剂的优化：经不同比例的乙腈提取比较,以目标化合物的响应面积和强度作为评价指标,得出在20%、40%、60%、80%的浓度里,80%乙腈水溶液作为提取溶剂时,那非物质的响应面积和强度较高、平均回收率高,故用80%的乙腈作为方法C的提取溶剂.
（3）样品稀释液的选择优化：由于质谱的灵敏度高,对于非法添加的化合物,高浓度的含量容易污染检测器或留有残留影响下一针的结果,应进一步稀释提取液再进行检测.试验发现,因为色谱检测中的溶剂效应影响,经一定浓度的乙腈水溶液配制的标准工作液的离子色谱图峰形相对纯乙腈较好.综合考虑流动相中乙腈的初始比例（约20%）及目标化合物的溶解性,采用20%的乙腈水溶液作稀释定溶液.
3.不同色谱柱的选择及比较.
为使目标化合物的峰形及分离效果达到最佳, 本实验选用三种色谱柱进行比较, 结果发现 G o ld-C18（ 1 5 0 m m × 4 . 6 m m , 3 μ m ） 的峰形及灵敏度最好, 另两种色谱柱的承受压力能力和出峰情况不及Gold-C18（150mm×4.6mm,3μm）,采用 BEH C18（100mm×2.1mm,1.7μm）时,有两种物质的出峰时间太早,易受基质或杂峰干扰；而SB-C18（3.0mm×50mm,
1.8μm）的耐压强度及使用寿命相对差,故选用Hypersil
Gold-C18（150mm×4.6mm,3μm）继续进行试验.
4.不同流动相条件的比较.
流动相的选择对目标物的离子化及质谱检测的灵敏度有一定作用.本实验按照1.3中不同流动相条件进行不同的流动相经梯度洗脱程序（表1）对11种那非物质进行分离,水相分别为0.1%甲酸+5mM乙酸铵溶液、0.1%甲酸溶液、5mM乙酸铵溶液,有机相为纯乙腈.结果表明,采用0.1%甲酸+5mM乙酸铵溶液-乙腈作为流动相,目标化合物的峰形尖锐、对称,优化后的11种那非物质的总离子流图见图1.
5.线性范围和检出限.
根据选定的色谱及质谱条件,采用方法C测定11种目标化合物的6水平混合标准工作液,分别以目标化合物的浓度（ng/mL）为X轴,对应峰面积为Y轴,绘制标准曲线,如表3所示,在1.0ng/mL-40.0ng/mL的范围内,线性关系良好,相关系数均大于0.999.根据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F.4对检出限（LOD）为噪音比S/N等于3的定义,得出11种那非物质相应的检出限.
6.方法的回收率和精密度.
准确称取阴性样品2.0g,添加低、中、高3水平的标准溶液,按方法C做加标回收实验,如表4所示,11种目标化合物的加标回收率范围为91.4%-118.9%,相对标准偏差( RSD,n等于6) 为2.5%-7.9%.说明本方法的准确度高,精密度良好.
7.样品的检测情况与分析.
按上述方法对配制酒、保健品、功能性饮料等50批次样品进行测定,对出现的疑似峰将出峰时间及二级质谱图的离子丰度比与标准品对照,定性分析发现50批样品中检测出5批次样品含有违禁那非物质,且均为西地那非,所检样品的阳性定量结果如表6.
由此可见此类药物非法添加现象普遍存在,需引起监管部门重视.
本研究结果表明,提取试剂及浓度对不同样品中目标化合物的提取效率不同,也为广大分析工作者提供了用高效液相色谱—串联质谱测定西地那非等11种非法添加药物残留量的检测方法.该方法快速、准确,为高通量检测其他非法添加药物提供有效的参考依据和方法思路借鉴.
从检测结果发现,配制酒及壮阳类保健品中违法添加的那非类药物以西地那非居多,应引起重视.另PDE-5抑制剂及其衍生物种类居多,不少商家为避开监管,添加新型罕见的类似药物,使得食品安全监管形势日趋复杂,任务更为艰巨.为更有效地规范市场,使行业更加健康、有序地发展,应进一步扩大检测范围,提高监管力度.
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