环介导等温扩增技术对锦鲤疱疹病毒的快速检测,该文是锦鲤方面有关论文写作技巧范文和锦鲤疱疹病毒和等温和快速检测方面学年毕业论文范文.
锦鲤论文参考文献：
0引言
锦鲤疱疹病毒病是由鲤疱疹病毒3型Cyprinidherpesvirus 3(CyHV-3)感染引起鲤鱼、锦鲤以及普通变种鳃坏死和间质性肾炎的一种高致病性、高传染性、高死亡率疾病.现已在全世界范围内流行,严重威胁着鲤鱼和锦鲤养殖业的发展.
目前,已经建立的对CyHV-3的检测方法有DNA杂交、PCR、套式PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增方法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)等.以上检测方法在临床检测中均存在局限,如仪器设备,技术人员和成本等.LAMP检测方法对仪器要求低,根据颜色变化通过肉眼可以对结果进行判断,适用于现地检测.
1材料与方法
1.1主要实验材料
含有CyHV-3 TK基因的重组质粒,Bst DNA聚合酶（长片段）、Thermopol II反应缓冲液,SYBRGreen I荧光染料,Betaine,dNTP,DNAMarker,病毒DNA提取试剂盒,
1.2引物设计
根据中华人民共和国水产行业标准中,鲤疱疹病毒检测方法要求的CyHV-3的TK基因的序列,使用Primer Explorer V4设计8条特异性引物（表1）,并交由上海生工合成.
1.3 LAMP扩增
Green I,65℃孵育60min,80℃lOmin灭活酶终止反应.
反应管淡绿色为阳性,淡橘为阴性.结果判定采用琼脂糖凝胶电泳检测.
1.4 LAMP反应条件优化
分别通过不同温度以及不同时间进行LAMP扩增,优化dNTPs、Betaine、MgClz等其他反应条件.
2结果
LAMP的建立和检测：以特异性引物对CyHV-3进行LAMP扩增,肉眼观察,CyHV-3阳性管浑浊．而阴性管未见浑浊,加入荧光染料SYBR Green I后,CyHV-3阳性管反应液变为淡绿色,而阴性对照管为棕色.
琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,CyHV-3阳性管出现典型的梯形条带,而阴性管没有产生条带.
经优化后,LAMP体系最佳反应时间为40min,最佳反应温度为65℃,dNTPs最适浓度为1.2mM、Betaine最佳浓度为0.8mM、MgCl2最佳浓度为8mM.
3讨论
自从锦鲤疱疹病毒发现以来,各个地区几乎每年都有流行.目前,锦鲤疱疹病毒病的全球性暴发,给锦鲤观赏业、鲤鱼养殖业以及国际贸易造成了严重的经济损失.
PCR是目前较为精确检测CyHV-3感染的方法.Bercovier等基于CyH V-3的胸苷激酶基因建立的PCR方法,能够区分CyHV-3与CyHV-l和CcVo刘荭等建立TnestedPCR,已作为我国检测CyHV-3的标准方法.范万红等建立的实时荧光定量PCR缩短了检测时间,适用于进出口检验检疫.LAMP法是一种新式恒温核酸扩增方法,该扩增法具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点.Gunimaladevi等基于TK基因设计引物,建立了快速检测CyHV-3的LAMP法.Soliman等在产物中加入SYBR Greenl,根据其颜色的变化来判定结果,从而更加直观.LAMP检测法不需要特殊的仪器设备,适合现场诊断.因此LAMP法具有良好的应用前景.
本实验建立的LAMP方法具有以下特点：第一速率快,仅40min左右即达到反应的平台期；第二、对反应装置要求较低,恒温水浴锅、PCR仪均能作为LAMP的恒温反应装置；第三、结果观察简单,添加SYBR Green I核酸染料后肉眼即可观察.本文提供了稳定的CyHV-3检测体系,为控制CyHV-3的流行与及时检测提供了技术支持.
致谢
本研究由河北省研究生创新项目提供资金支持通信地址
刘露：秦皇岛市河北大街东段52号河北农业大学海洋学院,秦皇岛066005,Email:toliulu0424@163．com,Te1118132731573
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