维生素C对内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响,该文是细胞相关自考开题报告范文和内皮细胞和滑肌和维生素类毕业论文的格式范文.
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摘 要:药物洗脱支架(DrugＧelutingstent,DES)释放抗增殖的药物来抑制平滑肌细胞(Smoothmusclecells,Cs)增殖,阻止内膜增生.但这些药物不可避免地会延迟内皮化,因此有必要寻找合适的药物选择性的抑制C增殖,同时促进内皮细胞(Endothelialcells,ECs)增殖.维生素C(LＧascorbicacid,LＧAA)是一种用于口服或是直接加入细胞培养的药物,因此实验中在培养过夜的EC和C细胞中加入浓度为３００μg/mL的LＧAA、浓度为１００μg/mL的雷帕霉素(Sirolimus,SIR)、高糖培养基(Dulbeccoodifiedeaglemedium,DMEM)、杜氏磷酸缓冲液(Dulbeccosphosphatebufferedsaline,DPBS)和乙醇各１００μL,培养７d观察,结果表明:SIR能够抑制EC增殖,而LＧAA能够显著促进EC的增殖,同时也能够抑制C的生长;在培养过夜的EC和C细胞中加入１００μL不同浓度的LＧAA(１、１００、３００、５００μg/mL和１０００μg/mL),培养７d后,１、１００μg/mL和３００μg/mL的LＧAA有利于EC增殖,而５００μg/mL和１０００μg/mL的LＧAA会抑制EC增殖,并且３００μg/mL和５００μg/mL的LＧAA可以显著抑制C增殖.由此表明维生素C可以成为潜在的用于药物洗脱支架的药物.
关键词:药物洗脱支架;内皮细胞;平滑肌细胞;维生素C;雷帕霉素
中图分类号:Q２８ 文献标志码:A 文章编号:１６７３Ｇ３８５１(２０１８)０５Ｇ０３５２Ｇ０５
０ 引 言
每年有数百万患者植入心血管支架,但心血管支架的主要问题之一是人造材料与血液接触有形成血栓或血块的趋势,血栓阻碍血液流向心脏或其他重要器官,可能具有致命的后果,因此,心血管支架的内皮化对预防血栓的形成至关重要[１Ｇ２].正常和健康的内皮细胞(Endothelialcells,ECs)通过释放前列环素和一氧化氮来防止血栓形成,前列环素和一氧化氮可以阻止血栓形成的关键步骤是抑制血小板粘附、聚集和活化,并且内皮细胞表面含有血栓调节蛋白,该蛋白在为这些细胞提供抗凝血过程中起着至关重要的作用[３Ｇ４].尽管过去已经研发多种材料来改善血管支架的血液相容性,但是内皮化仍然被认为是长期避免血栓形成的最佳方法.
目前可用的药物洗脱支架(DrugＧelutingstent,DES)通过释放抗增殖药物如雷帕霉素(Sirolimus,SIR)和紫杉醇(Paclitaxel,PAT)来治疗内膜增生[５].内膜增生是在植入支架期间发生动脉损伤的伤口愈合反应,内膜增生发生的主要原因是平滑肌细胞(Smoothmusclecells,Cs)的生长和迁移导致管腔内的细胞外基质沉积阻塞动脉[６Ｇ７].支架释放的抗增殖药物能够抑制C的生长来控制内膜增生,但这些药物同时也会抑制EC 生长[８].药物洗脱支架的受损或延迟内皮化被认为是晚期支架血栓形成的主要原因,严重的并发症可能导致心脏病发作或死亡[９Ｇ１０].PAT 血管支架表现出显著的延迟内皮化,这可能会导致晚期血栓的形成[１１].因此,有必要寻找一种既能抑制C 生长又能促进EC生长的药物.维生素C(LＧascorbicacid,LＧAA)是一种用于口服给药或者直接添加到细胞培养中的药物,相关研究发现LＧAA 在调节炎症反应中发挥作用,同时也对EC有一定的保护作用[１２Ｇ１４].本文研究的长期目标是从DES释放LＧAA来改善支架的内皮化,防止晚期血栓形成以及抑制C生长,从而防止新生内膜增生.作为实现这一研究目标的第一步,本文进行四组体外细胞培养实验,以验证与其他常用于心血管支架的药物(SIR)相比,LＧAA可以促进EC生长的同时抑制C的生长.
１ 材料和方法
１．１ 材料
大鼠主动脉平滑肌细胞、内皮祖细胞(中国科学院上海科学院),胎牛血清和胰酶消化液(美国Gibco公司),高糖DMEM 培养基(美国Hyclone公司),MTT、维生素C和雷帕霉素(美国sigmaＧaldrich公司),DMSO和live/dead染液(美国ThermoFisher公司).所用试剂均为分析纯.
１．２ 溶液配制
MTT(５mg/mL):称取５００mgMTT,溶于１００mLPBS中,磁力搅拌器搅拌至溶解,４℃避光保存.
LＧAA 母液:称取２０mgLＧAA,溶于１mL 杜氏磷酸缓冲液(Dulbeccos phosphate bufferedsaline,DPBS)中,４℃避光保存.
SIR母液:称取２０mgSIR,溶于１mL无水乙醇中,４℃保存.
１．３ LＧAA 和SIR对两种细胞增殖作用的研究
将LＧAA母液用高糖培养基(Dulbeccoodifiedeaglemedium,DMEM)稀释至３００μg/mL,SIR母液用DMEM 培养基稀释至１００μg/mL.取对数生长期的EC和C细胞均以１．５×１０４ 个/mL的浓度、１００μL接种于９６孔板中,３７℃二氧化碳培养箱培养过夜,分别加入１００μLLＧAA、SIR、DMEM、０．５％ DPBS和０．５％乙醇溶液.１、３、５d和７d(每隔１d换一次液)观察细胞生长形态,再加入１０μLMTT溶液,放置细胞培养箱培养４h后,吸净孔板中的细胞培养基,每孔加入１５０μLDMSO,放在摇床上１０min,转速为１２０r/min.用酶标仪在４９０nm处测量吸光值.计算细胞存活率,利用Sigmaplot软件进行统计学分析.
１．４ 不同的LＧAA浓度对两种细胞增殖作用的研究
将LＧAA 母液用DMEM 培养基稀释至１、１００、３００、５００μg/mL和１０００μg/mL.取１００μL对数生长期、浓度为１．５×１０４ 个/mL的EC和C细胞接种于９６孔板中,３７℃二氧化碳培养箱培养过夜,分别加入１、１００、３００、５００μg/mL和１０００μg/mL的LＧAA 溶液和DMEM,DPBS溶液各１００μL.分别在１、３、５d和７d(每隔１d换一次液)观察细胞生长形态,加入１０μLMTT溶液,再放置细胞培养箱培养４h后,吸净孔板中的细胞培养基,每孔加入１５０μLDMSO,放在摇床上１０min,转速为１２０r/min.用酶标仪在４９０nm 处测量吸光值.计算细胞存活率,利用Sigmaplot软件进行统计学分析.
１．５ live/dead荧光染色观察细胞形态
１．５．１ LＧAA 和SIR对两种细胞增殖作用的影响
将LＧAA母液用DMEM培养基稀释至３００μg/mL,SIR母液用DMEM 培养基稀释至１００μg/mL.取对数生长期的EC和C细胞以１．５×１０４ 个/mL的浓度、５００μL接种于２４孔板中,３７℃二氧化碳培养箱培养过夜,分别加入LＧAA,SIR,DMEM,０．５％DPBS,０．５％乙醇溶液.在１、３、５d和７d(每隔１d换一次液),加入live/dead荧光染料,室温避光染色３０min,在倒置荧光显微镜下观察,并拍照记录.
１．５．２ 不同的LＧAA浓度对两种细胞增殖作用的影响将LＧAA 母液用DMEM 培养基稀释至１、１００、３００、５００μg/mL和１０００μg/mL.取对数生长期的细胞EC和C均以１．５×１０４ 个/mL的浓度、５００μL接种于２４孔板中,３７℃二氧化碳培养箱培养过夜,分别加入１、１００、３００、５００μg/mL和１０００μg/mL的LＧAA溶液、DMEM和DPBS溶液.在１、３、５d和７d(每隔１d换一次液),加入live/dead荧光染料,室温避光染色３０min,在倒置荧光显微镜下观察,并拍照记录.在实验１．３和１．５．１中,将不同的药物加入EC和C 细胞中,由于０．５％乙醇(溶于SIR)或是０．５％ DPBS(溶于LＧAA)都溶于培养基,因此以上实验设有３个对照组,对照组１为DMEM 并且不加药和任何溶剂(乙醇溶液或是DPBS),对照组２为０．５％ DPBS溶于DMEM(不加LＧAA),对照组３为０．５％乙醇溶于DMEM(不加SIR).在实验１．４和１．５．２中,将不同剂量的LＧAA加入细胞EC和C,由于LＧAA 溶于DPBS,因此以上实验设有２个对照组,对照组１为DMEM 并且不加药和任何溶剂(乙醇溶液或是DPBS),对照组２为１０％ DPBS溶于DMEM(不加LＧAA).
２ 实验结果与分析
２．１ LＧAA 和SIR对内皮细胞增殖作用的影响
用MTT法检测EC细胞在加入不同药物处理后的活性,结果如图１所示.在第１d,３个对照组和LＧAA没有明显的差异,而SIR与对照组或是LＧAA相比,只有较少的细胞数量.在第３d,LＧAA相比于第１d细胞有一定增殖趋势,但与对照组相比略低;而SIR与第１d相比,细胞数量没有明显的增殖,第５d和第７d可以看到相似的规律.以上结果表明,LＧAA有促进EC增殖的能力,而SIR能够抑制EC的增殖.采用live/dead荧光染色观察细胞形态及数量,结果如图２所示,结果表明,与３个对照组和LＧAA相比,随着天数的增加,SIR的细胞数量无明显的增长,而LＧAA细胞数量有一个稳定的增长,但与对照组相比略低,这与图１所述的MTT检测结果一致.
２．２ 不同的LＧAA 浓度对内皮细胞的增殖影响
EC细胞中加入不同浓度LＧAA 的MTT 检测结果如图３所示,在第１d,５００μg/mL的LＧAA 和对照组与其他浓度组有明显的差异.第３d时,除了５００μg/mL和１０００μg/mL,对照组和其他浓度组都有明显的增长,第５d有相似的增长趋势.在第７d,１、１００、３００μg/mL的LＧAA与其他浓度组及对照组相比,达到最高的细胞增殖量,１０００μg/mL的LＧAA细胞增殖量最少.以上结果表明,１、１００、３００μg/mL的LＧAA有利于EC增殖,而５００μg/mL和１０００μg/mL的LＧAA 会抑制EC细胞增殖.live/dead荧光染色的结果如图４,与两个对照组相比,随着天数的增加,１、１００μg/mL和３００μg/mL的LＧAA 处理EC细胞保持较高的增殖水平,而５００μg/mL和１０００μg/mL的LＧAA 的细胞增殖量不高,这与所述的MTT 结果一致.
２．３ LＧAA 和SIR对平滑肌细胞增殖作用的影响
用MTT法检测C细胞在加入不同药物之后的活性的结果如图５所示.在第１d,LＧAA和SIR处理细胞数目明显低于对照组;第３d,加入LＧAA 和SIR后C细胞有微量的增长,与对照组相比较仍旧很低,同时LＧAA和SIR之间没有明显的差异.第５d和第７d有相似的趋势.因此LＧAA可以显著的抑制C的增殖,尽管抑制效果稍低于SIR.live/dead荧光染色的结果如图６,与３个对照组相比,随着天数的增加,SIR和LＧAA 组的细胞数量极少,并且没有明显的增长,这与所述MTT结果一致.
２．４ 不同浓度LＧAA对平滑肌细胞增殖作用的影响
C细胞中加入不同浓度LＧAA的MTT结果如图７所示.第１d,与对照组相比较而言,３００μg/mL和５００μg/mL的LＧAA显示较低的增殖量,１μg/mL和１００μg/mL与对照组相比无明显差异.第３d,３００μg/mL和５００μg/mL的LＧAA 和对照组相比依旧显示较低水平的增殖量,而１０００μg/mL的LＧAA 与第１d相比增殖量显著下降.第５d和第７d有显示相似的规律.同时,笔者采用live/dead荧光染色观察细胞形态及数量,结果如图８所示,结果表明,与２个对照组相比,１、１００μg/mL和１０００μg/mL的LＧAA 随着天数的增加细胞数量也在不断增加,而３００μg/mL和５００μg/mL的LＧAA细胞增殖量较低.这与上述的MTT检测结果一致,３００μg/mL和５００μg/mL 的LＧAA 与其他浓度组及对照组相比能够显著抑制C增殖.
３ 结 论
本文通过比较在相同条件下LＧAA 和SIR 对EC和C的影响,发现SIR能够抑制EC增殖,而LＧAA 可以促进EC 增殖的同时抑制C 增殖.不同浓度LＧAA 对EC和C的研究表明１、１００、３００μg/mL的LＧAA有利于EC增殖,而５００μg/mL和１０００μg/mL的LＧAA会抑制EC增殖;３００μg/mL和５００μg/mL的LＧAA 可以显著抑制C增殖.因此本文表明LＧAA 的作用效果优于SIR,可以成为潜在的应用于药物洗脱支架的药物.
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